天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为C010-2-1、C009-2-1、A001-1、A003-1）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（江苏酶标生物科技有限公司，批号MB-172/A）；五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、5-羟甲基糠醛（5-HMF）（中国食品药品检定研究院，批号分别为110857-201412、111529-201706、110764-201111、110765-200710、111626-201912，质量分数分别为99.4%、99.2%、99.5%、99.0%、99.9%）；丙烯酰胺（德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；纯净水、乙腈为色谱纯级别，其他试剂均为分析纯级别。
药材五味子来源见表1，经黑龙江中医药大学孙慧峰教授鉴定为木兰科植物五味子S. chinensis（Turcz.）Bail.的干燥成熟果实，习称“北五味子”，符合《中国药典》2020年版一部相关项下的规定。
1.2实验动物
清洁级健康ICR雄性小鼠90只，体质量为（20±2）g，小鼠和饲料均购自黑龙江中医药大学实验动物中心，实验动物生产许可证编号为SCXK（黑）2018-005，动物实验经黑龙江中医药大学伦理委员会批准，实验动物伦理号为2019071801，按3R原则给予人道关怀。
2方法与结果
2.1HPLC指纹图谱的建立
2.1.1醋五味子炮制参照《中国药典》2020年版四部（通则0231）项下醋炙法，每批药材均取6份生五味子，每份100 g，加米醋20 g，拌匀后闷润2 h，在米醋沸点条件下，分别蒸至1、2、3、4、5、6 h后，放凉，干燥，即得。
2.1.2供试品溶液的制备分别取10批生五味子和对应批次的不同醋制时间下的醋五味子，粉碎，取粉末3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率250 W、频率40 kHz）20 min，放冷，再精密称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.1.3对照品溶液制备 分别精密称取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、5-HMF和丙烯酰胺适量，置棕色量瓶中，分别加甲醇制成质量浓度为：五味子醇甲0.304 mg·mL-1、五味子酯甲0.302 mg·mL-1、五味子甲素0.302 mg·mL-1、五味子乙素0.304 mg·mL-1、5-HMF 0.117 28 mg·mL-1和丙烯酰胺0.314 mg·mL-1的对照品溶液。
2.1.4色谱条件Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相选择水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，95% A；10～25 min，95%～49% A；25～30 min，49% A；30～40 min，49%～15% A；40～50 min，15% A），体积流量0.8 mL·min-1；检测波长220～280 nm，二极管阵列检测器（DAD）；柱温30 ℃；进样量10 μL。
2.1.5精密度考察取醋制3 h S7五味子供试品溶液，按“2.1.4”项下色谱条件连续进样6次，进样量10 μL，记录色谱图，以13号峰五味子醇甲为参比峰，计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均＜3.0%，表明仪器精密度良好。
2.1.6稳定性考察取醋制3 h S7五味子供试品溶液，按“2.1.4”项下的色谱条件，在0、2、4、6、8、12 h测定，记录色谱图，以13号峰五味子醇甲为参比峰，计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均＜3.0%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。
2.1.7重复性考察取醋制3 h S7五味子供试品溶液6份，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.4”项下色谱条件测定，以13号峰五味子醇甲为参比峰，计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均＜3.0%，表明本方法重复性良好。
2.1.8样品测定及相似度评价分别精密吸取生五味子和醋制五味子供试品溶液，按“2.1.4”项下色谱条件测定，记录色谱图。相关数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”（2012A版），以S1为参照色谱，自动匹配图谱，利用中位数法生成指纹图谱和对照指纹图谱。根据色谱图中物质组分的分离度、保留时间结合峰面积值，确定五味子醇甲（13号色谱峰）作为参比峰，共匹配出6个特征峰，与对照品色谱峰比对，确定1号峰为丙烯酰胺、2号峰为5-HMF、13号峰为五味子醇甲、20号峰为五味子酯甲、21号峰为五味子甲素、23号峰为五味子乙素。采用自动匹配模式计算出10批醋制五味子指纹图谱相似度评价结果，见图1、2及表2。
对10批次不同醋制时间五味子指纹图谱与对照指纹图谱相似度组内对比发现，相似度均在0.913～0.999，相似度良好，说明了组内10批醋制五味子质量的均一性及稳定性。
2.2醋制五味子各成分含量测定
2.2.1对照品溶液的配制同“2.1.3”项下对照品溶液配制方法。
2.2.2供试品溶液的配制同“2.1.2”项下供试品溶液配制方法。
2.2.3色谱条件同“2.1.4”项下色谱条件。
2.2.4线性关系考察分别精密量取混合对照品储备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于1 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述系列溶液各20 μL，注入色谱仪，按“2.1.4”项下的色谱条件测定峰面积。
以峰面积积分值为纵坐标，进样量为横坐标，得各组分回归方程、线性范围和相关系数。其中丙烯酰胺：Y＝2×106 X＋2.972 6（r2＝0.999 2）；5-HMF：Y＝1×107 X－35 764（r2＝0.998 3）；五味子醇甲：Y＝5×107 X＋454 414（r2＝0.997 4）；五味子酯甲：Y＝4×107 X＋24 556（r2＝0.997 5）；五味子甲素：Y＝1×108 X＋689 522（r2＝0.997 0）；五味子乙素Y＝5×107 X＋463 458（r2＝0.999 7），结果表明丙烯酰胺、5-HMF、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素分别在0.096 96～0.969 60 mg·mL-1、0.058 64～0.586 40 mg·mL-1、0.043 32～0.433 20 mg·mL-1、1.449 6～14.496 0 μg·mL-1、0.011 52～0.115 20 mg·mL-1、0.041 52～0.415 20 mg·mL-1内呈良好的线性关系。
2.2.5精密度试验取“2.1.3”项下的混合对照品溶液，连续进样6次，按“2.1.4”项下的色谱条件测定，结果显示五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、丙烯酰胺和5-HMF保留时间RSD值＜0.3%，峰面积RSD＜2%，表明仪器精密度良好。
2.2.6重复性试验取醋制3 h S7五味子供试品溶液6份，每份约3 g，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.4”项下色谱条件连续进样，进样量10 μL，结果显示五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、丙烯酰胺和5-HMF保留时间RSD值＜0.3%，峰面积RSD＜2%，说明本方法具有良好重复性。
2.2.7稳定性试验取醋制3 h S7五味子供试品溶液，按“2.1.4”项下的色谱条件在0、2、4、6、8、12 h进样，进样量10 μL，结果显示五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、丙烯酰胺和5-HMF保留时间RSD值＜0.4%，峰面积RSD＜2%，说明在12 h测定范围内，供试品溶液稳定。
2.2.8加样回收率试验精密称定已知各待测成分质量分数的五味子药材约1 g，共9份，分别加入约药材中各成分质量分数的80%、100%、120%对照品，按“2.1.3”项下的方法制成供试品溶液，每个质量浓度平行3份，按“2.1.4”项下的色谱条件测定，并计算加样回收率和RSD。结果显示，加样回收率在95%～105%，按照丙烯酰胺、5-HMF、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素的顺序，平均回收率分别为101.8%、101.9%、100.5%、101.0%、100.3%、101.4%，RSD分别为1.21%、2.02%、2.14%、1.50%、2.66%、1.69%，提示该方法准确性良好。
2.2.9含量测定按“2.1.4”项下色谱条件进样分析，测定不同醋制时间下五味子中不同物质组分变化趋势。对生五味子及不同炮制时间五味子物质组分对比，随着蒸制时间的延长，五味子中5-HMF整体呈上升趋势；醋制3 h时五味子酯甲较生五味子质量分数略有增加，而后随着时间延长逐渐减小；醋制1～6 h内五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素质量分数较生五味子变化不大，见图3。
2.3醋制五味子对CCl4致小鼠急性肝损伤保护作用
2.3.1动物模型制备与给药将小鼠随机分为醋制1、2、3、4、5、6 h五味子（S7）给药（C1、C2、C3、C4、C5、C6，相当于生药量26.000 g·kg-1）组，对照组，双环醇（阳性药，0.325 g·kg-1）组和模型组，每组10只，雌雄各半，对照组和模型组ig给予等体积0.9%氯化钠溶液，连续给药7 d。末次给药1 h后，除对照组外，其余各组小鼠ip 0.2%的CCl4橄榄油溶液（10 mL·kg-1）［11-12］。
2.3.2生化指标检测及数据分析建立CCl4致肝损伤小鼠模型后，禁食不禁水16 h，眼眶取血，3 000 r·min-1离心15 min分离血清，最后置于4 ℃冰箱中保存备用。分别按照AST、ALT、TNF-α、MDA和SOD各自的试剂盒说明书操作，测定相应含量。
所采集的数据均利用SPSS 21.0软件进行统计分析，以±s表示计量数据，t检验进行两两比较。
2.3.3肝损伤保护作用考察与对照组比较，模型组小鼠血清中AST、ALT、TNF-α、MDA水平均显著升高（P＜0.01），SOD水平显著下降（P＜0.05、0.01）。与模型组比较，C2、C3、C6组AST、ALT、TNF-α、MDA水平显著降低，SOD水平显著升高（P＜0.01）；C1组AST、MDA水平显著降低，SOD水平显著升高（P＜0.01）；C4组AST、ALT水平显著降低，SOD水平显著升高（P＜0.01）；C5组AST、ALT、TNF-α水平显著降低，SOD水平显著升高（P＜0.01）。组间对比发现，随着炮制时间延长，C3组AST、ALT与模型组对比下降明显，TNF-α、MDA较模型组有所下降，SOD较模型组升高明显，药效学指标明显较好，其后C4、C5组血清中AST、ALT、TNF-α、MDA水平逐渐升高，SOD水平逐渐下降，C6组除了ALT、TNF-α持续上升外，AST、MDA、SOD水平逐渐较C4、C5组有所降低。故以醋制3 h五味子指纹图谱与药效学之间关联性建立谱-效关系研究。见表3。
2.4指纹图谱与抗肝损伤作用灰色关联分析（GRA）
2.4.1原始数据的无量化处理以醋制3 h五味子指纹图谱中代表性的6个特征峰峰面积（表4）数据，对ALT、AST、TNF-α、MDA和SOD量值进行GRA［14］。本研究采用均值法，均值化ALT、AST、TNF-α、MDA和SOD数据，见表5。
2.4.2计算参考数列与比较数列的灰色关联系数将药效学指标ALT、AST、TNF-α、MDA和SOD的水平设定为母序列（参考序列，Yj），依次记为Y1～Y5，色谱图中各特征峰峰面积设定为子序列（比较序列，Xi），即X1～X6，计算特征峰峰面积与5组药效学指标的关联系数。由表6可知，设定关联度＞0.6为影响谱-效的主要贡献者［14］，醋制3 h五味子中五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素、丙烯酰胺和5-HMF对各药效学指标有明显的影响。
2.5指纹图谱与肝损伤指标的正交偏最小二乘法（OPLS）分析
2.5.1OPLS回归方程的建立及分析以各共有峰的峰面积作为自变量，肝损伤指标AST、ALT、TNF-α、MDA、SOD作为因变量，利用SIMCA 14.1软件，将其分别进行OPLS相关性回归分析，自动拟合到回归方程：
YAST＝m1＋a1X1＋a2X2＋……a6X6
YALT＝m2＋b1X1＋b2X2＋……b6X6
YTNF-α＝m3＋c1X1＋c2X2＋……c6X6
YMDA＝m4＋d1X1＋d2X2＋……d6X6
YSOD＝m5＋e1X1＋+e2X2＋……e6X6
X1～X6为共有峰峰面积数值，a1～a6、b1～b6、c1～c6、d1～d6、e1～e6为共有峰与肝损伤指标的回归系数，m1～m5为常数项
结果如图4所示，相关系数符号反映与小鼠肝损伤指标的相关性，由于小鼠肝损伤指标AST、ALT、TNF-α、MDA与药效呈负相关，故回归系数为负数的色谱峰是对药效的贡献峰。肝损伤指标AST：5-HMF、五味子乙素的回归系数为负数；肝损伤指标ALT：五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的回归系数为负数，五味子乙素、5-HMF及五味子醇甲对小鼠肝损伤作用影响较明显。对于指标TNF-α、MDA、SOD，5-HMF、五味子醇甲对小鼠肝损伤作用影响较明显。
2.5.2变量重要投影（VIP）分析VIP是评价变量对分类贡献的常用指标，VIP值越大表明其对该成分的贡献率越大，结果见图5。综合肝损伤各指标的分类贡献，发现ALT、AST、TNF-α、SOD和MDA中，色谱成分峰的5-HMF、五味子乙素、五味子醇甲VIP值较大，推测这3种成分为改善小鼠肝损伤的主要贡献成分。其中5-HMF、五味子乙素各指标VIP值＞1，五味子醇甲部分指标VIP值＞1。
3讨论
“醋制入肝”，始载于《内经》中的五脏理论，“肝欲散，急食辛以散之，用辛补之，酸泻之”，传统中医理论认为酸既有泻肝，亦有补肝等功效。随着中药现代化发展，醋制中药中的药性及成分变化研究逐渐兴起［15］。谱效关系分析利用现代分析技术，以合理的数据处理方法与合适的药理模型进行中药现代化分析［16］。本研究结合GRA及OPLS分析2种谱效关系分析方法，通过HPLC色谱图筛选，在检测波长为280 nm时，共匹配出6个特征峰，与对照品色谱峰比对，确定1号峰为丙烯酰胺，2号峰为5-HMF，13号峰为五味子醇甲，20号峰为五味子酯甲，21号峰为五味子甲素，23号峰为五味子乙素。
在《中国药典》2020年版中，并未明确给出醋制项下五味子的最佳具体时间，高慧等［17］通过单因素考察蒸制和闷润时间对五味子醋制过程中6种木质素类成分变化，确定最佳炮制工艺为闷润1.5 h，蒸制3 h；葛会奇等［18］也通过正交试验，探究蒸煮时间，加醋量，闷润时间对醋制五味子的最佳炮制工艺，发现最佳工艺为闷润时间2 h，蒸制时间3 h，结合以上实验结果最佳工艺，定量闷润时间及给醋量后，考察1～6 h不同醋制时间的五味子内物质成分变化及其对肝损伤小鼠的抗肝损伤程度。值得注意的是，随着蒸制时间的延长，不同时间的五味子呈现不同程度的颜色变化，0～3 h时颜色逐渐由红转为黑，4 h后颜色趋于稳定，同时，随着蒸制时间的延长，五味子中5-HMF呈上升趋势，说明此时五味子内发生了美拉德反应，组间对比发现，醋制3 h时五味子酯甲较生五味子含量增加，而后随着时间延长逐渐减小，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素较生五味子变化不大。考虑作为炮制过后美拉德反应的副产物5-HMF成分［19］，在抑制肝损伤层面，与含量增加的有效成分五味子酯甲协同作用。
CCl4致小鼠急性肝损伤模型是经典实验性肝损伤动物模型，在人类与动物中表现出相似的病理变化，通过将CCl4溶于脂溶性基质中以ip等方法实现给药过程［20-21］。肝脏为氨基酸代谢和核苷酸合成的主要器官，当其受到CCl4影响时，氨基酸代谢发生紊乱［22］，当CCl4进入机体后，激活体内CCl4代谢反应，产生三氯甲基自由基等自由基活性中间体，此类中间体会结合细胞膜上磷脂类分子，改变细胞膜通透性，致使膜内活性物质AST、ALT等流出，故此部分指标可用以判断肝损伤程度，且呈正相关。当CCl4与膜上脂质接触时，则产生大量脂质过氧化物MDA。SOD是体内一种重要的过氧化酶，其一般用作清除氧化自由基的重要指标，活性程度反映机体抗氧化能力，测定MDA与SOD可有效评判肝损伤的程度［23］。而TNF-α是介导肝损伤的主要因子，具有一定的促炎症性［24］，降低其含量可起到抑制炎症，从而保护肝脏的作用。通过测定小鼠肝组织中MDA、SOD和TNF-α的含量，从炎症因子水平的角度探索中药五味子炮制前后对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用。
动物实验结果发现醋制五味子治疗组与模型组相比，MDA水平明显降低，SOD含量显著升高，TNF-α含量降低，提示醋制五味子可抑制肝细胞的氧化应激，阻止肝细胞脂质过氧化，维持细胞质膜的正常结构，并降低炎症因子的释放，从而保护受损肝脏。通过5个药效学指标的数据对比分析发现醋制3 h的五味子对急性肝损伤的保护作用最强，进一步将醋制3 h五味子特征峰相对峰面积与药效学指标进行谱效关系分析。设定特征峰峰面积与5组药效学指标的关联度＞0.6，主要贡献者排序为五味子醇甲＞五味子乙素＞五味子甲素＞丙烯酰胺＞5-HMF＞五味子酯甲。由于小鼠肝损伤指标AST和ALT与药效呈负相关，五味子乙素、5-HMF及五味子醇甲对小鼠肝损伤作用影响较显著。对于指标TNF-α、MDA、SOD，5-HMF、五味子醇甲对小鼠肝损伤作用影响较明显。VIP综合肝损伤各指标的分类贡献，发现ALT、AST、TNF-α、SOD和MDA中，色谱成分峰的5-HMF、五味子乙素、五味子醇甲VIP值均值＞1，推测这3种成分为改善小鼠肝损伤的主要贡献成分。但不同炮制方法与不同温度的变化对醋制五味子有效成分含量变化与治疗肝损伤功效的相关性，仍需继续研究。
本研究初步探讨了固定温度下不同炮制时间的醋五味子的稳定均一性及有效成分含量变化，结合中医传统理论“醋制入肝”，确定了醋五味子抑制急性肝损伤的主要有效成分，同时将炮制过程中产生的美拉德反应副产物与有效成分的含量变化对肝损伤治疗的作用，一并纳入研究内容，确认了多个有效成分（五味子乙素、五味子醇甲、5-HMF等）对肝损伤作用，有助于规范中药饮片炮制、生产及质量控制，为推动中药炮制向科学化、现代化发展提供参考。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：葛宏霞，李思琪，梅景晨，王莹，陈大忠．基于中药炮制“醋制入肝”理论醋五味子对急性肝损伤作用谱效关系研究 [J]. 药物评价研究, 2023, 46(9):1897-1907.返回搜狐，查看更多